česky | english
Heslo:
Home

Technologie DNA mikročipů výrazně zlepšuje genetickou diagnostiku u dětí s mentální retardací

Autoři: Petr Kuglík, Eva Zrnová, Vladimíra Vranová

Pro medicínu 3. tisíciletí je charakteristický progresivní rozvoj nových laboratorních metod, které jsou založeny na využití nejmodernějších poznatků genetiky a molekulární biologie. Na mnoha pracovištích FN v Brně jsou tyto technologie rozvíjeny zejména absolventy Přírodovědecké fakulty, jejichž uplatnění v moderní medicíně se stává naprostou nutností.


V Laboratoři molekulární cytogenetiky jsou ve spolupráci s lékaři Oddělení lékařské genetiky FN Brno již více než 10 let průběžně zaváděny nové molekulárně cytogenetické laboratorní metody, které umožňují stále účinněji odhalovat genetické příčiny vrozených vývojových vad a jiných dědičných chorob.
Novinkou na našem pracovišti je technika komparativní genomové hybridizace s využitím oligonukleotidových DNA mikročipů (array-CGH), která je využívána v klinické praxi při vyšetřování pacientů od počátku roku 2008. Tato metoda je schopna odhalit drobné změny sekvencí DNA (např. zmnožení či ztráty určitých genů) na kterémkoli chromozomu lidského karyotypu. Na rozdíl od metody fluorescenční hybridizace in situ (FISH) již nevyšetřujeme pouze jednu chromozomovou aberaci, která by mohla být spojena s daným projevem onemocnění, ale prohledáváme celý genom, tedy veškerou genetickou informaci pacienta.

Se zavedením analýzy genomu pomocí čipových technologií se významným způsobem posunula citlivost určování genetických změn, neboť u každého pacienta můžeme v rámci jediného vyšetření analyzovat desítky až tisíce genů najednou.

Technologie array-CGH byla poprvé popsána Salinasem-Toldem v roce 1997 její podstatou hybridizace izolované DNA z krve pacienta na specifický mikročip.

DNA mikročip představuje skleněná či jiná polysyntetická destička podobná klasickému mikroskopickému sklíčku, na kterou jsou fixovány fragmenty lidské DNA. Tyto fragmenty jsou vybírány a fixovány na sklíčko tak, aby jejich prostřednictvím byl pokryt celý lidský genom. Čím více genových fragmentů je umístěno na čip, tím vyšší je rozlišovací schopnost mikročipu. Na našem pracovišti využíváme při vyšetřování pacientů DNA mikročip obsahující 44 000 nebo 105 000 oligonukleotidových DNA sond od firmy Agilent (Human Genome CGH Microarray 44K nebo 105K).
Základní principem DNA mikročipu je hybridizace kontrolní a testované DNA (naznačené odlišnými fluorescenčními barvami) ke genomovým fragmentům navázaným na sklíčku. Po hybridizaci těchto DNA sond k čipu je výsledek odečítán pomocí speciálního laserového čtecího zařízení (scanneru), který je umístěn v Univerzitním výzkumném centru – České myelomové skupiny v bohunickém kampusu. Při snímání obrazu nás zajímají rozdílné intenzity fluorescence jednotlivých fragmentů, z nichž jsme schopni určit ztráty či zisky genetického materiálu testované DNA oproti normální kontrolní DNA.

Vzhledem k schopnosti podrobného vyšetřování nebalancovaných chromozomových změn v genomu a také vzhledem k plné automatizaci představuje uvedená metoda DNA mikročipů jeden z nejlepších nástrojů současné molekulární cytogenetiky. I když se zatím jedná o finančně náročné vyšetření, je zřejmé, že do budoucna bude mít tato technologie rozhodující úlohu nejen při genetickém vyšetření pacientů s vrozenými vývojovými vadami, ale zejména u pacientů s onkologickým onemocněním. Již dnes v rámci rozsáhle vědecké činnosti naši laboratoře v rámci Babákova výzkumného institutu jsou prováděny pilotní studie zaměřené na rutinní využití technologie array-CGH a DNA mikročipů pro účely genomové profilace a detekce prognosticky významných chromozomových změn u pacientů s mnohočetným myelomem.


Ukázka práce s DNA mikročipem. Nakapání kontrolní a testované DNA na čip vyžaduje vysokou zručnost a pečlivost vyškolených pracovníků. 

 


Technologie DNA mikročipu využívaná v našich laboratořích:

Analyzátor

a) Mikročip Agilent´s Human CGH Microarray 44K

 

Čtečka
b) Scanner Agilent – čtečka DNA mikročipu

 

Výsledek
c) Výsledný obraz DNA mikročipu nasnímaný pomocí čtečky. Zelené body ukazují nadbytečný genetický materiál v testovaném vzorku DNA a červené signály reprezentují chybějící genetický materiál.

 

Využití DNA mikročipů u pacientů s psychomotorickou retardací

Na OLG FN Brno přichází ročně průměrně 80 pacientů s diagnózou psychomotorické retardace a různými faciálními stigmaty. Naším úkolem je odhalit případnou genetickou příčinu jejich poruchy, a pomoci tak stanovit přesnější diagnózu a další prognózu jejich onemocnění.

Mentální retardace (MR) je poměrně častá porucha, vyskytující se u 2-3% populace, přičemž těžké formy tohoto nevyléčitelného postižení vyřazují pacienta z běžného života. Na vzniku onemocnění se podílí řada faktorů, ať už jsou to faktory genetické nebo faktory životního prostředí. Původ onemocnění je odhalen asi u poloviny postižených, v ostatních případech zůstává příčina neobjasněna.

Mezi genetické příčiny MR patří často i vrozené chromozomové abnormality. Může jít o změnu počtu chromozomů (nejznámější příčinou MR je trizomie 21. chromozomu – Downův syndrom) či o změnu jejich struktury (zmnožení či ztráta genetického materiálu – duplikace, delece určitých částí chromozomů nebo jednotlivých genů). V poslední době bylo zjištěno, že zejména změny v koncových oblastech chromozomů (v tzv. subtelomerických oblastech) mohou být významnou příčinou MR. Velikost těchto přestaveb je však příliš malá na to, aby mohly být odhaleny metodami klasické cytogenetiky (G-pruhováním), a proto při zjišťování těchto genetických abnormalit přicházejí na řadu právě postupy cytogeneticky molekulární. I v těchto případech je vyšetření velmi složité a finančně náročné, neboť genetické abnormality mohou postihovat kterýkoliv chromozom, a proto je zapotřebí pro jejich odhalení často používat kombinace různých metod vyšetření (FISH, MLPA, CGH).

Od roku 2006 jsme v Laboratoři molekulární cytogenetiky provedli molekulárně cytogenetické vyšetření u 216 pacientů s psychomotorickou retardací a s různými vrozenými vývojovými vadami. Pomocí všech doposud dostupných metod jsme u 14% pacientů objevili změnu v jejich genetickém materiálu (nadbytečný či chybějící materiál), který by mohl být příčinou jejich onemocnění.

Metodou array-CGH s využitím DNA čipů bylo u nás vyšetřeno zatím 20 pacientů, avšak u 11 z nich jsme zaznamenali pozitivní výsledek vyšetření. Zavedení techniky array-CGH do klinické praxe tak výrazně zvyšuje účinnost genetických vyšetření a šetří náklady na používání měně citlivých metod.

Pro doplnění uvádíme výsledek vyšetření sedmiletého pacienta, který na OLG přišel s následující indikací: těžká psychomotorická retardace, faciální dysmorfie, stigmatizace v obličeji a hypertelorismus. Pomocí metody array-CGH jsme v rámci jediného vyšetření prokázali u tohoto pacienta dvě genetické abnormality, ztrátu (deleci) části chromozmu 4 o velikosti 3,7 Mb - del(4)(p16.2pter) a zmnožení (duplikaci) na chromozomu 8 o velikosti 6,5 Mb - dup(8)(p23.2pter). Následně budou vyšetřeni oba rodiče probanda pro upřesnění původu genetické příčiny jeho vrozeného onemocnění.

Chromozom 4
Profil chromozomu č. 4 s chybějícím genetickým
materiálem znázorněným červenou barvou

Chromozom 8
Profil chromozomu č. 8 s nadbytečným genetickým
materiálem zachyceným zelenou barvou

Zdroj: Nemocniční listy 2, ročník 10, 8-9, 2009

14.8.2009


Zpět